在一些微生物实验室或者需要无菌操作的场所，想了解灭菌的具体效果就需要生物指示物的帮助。通常灭菌指的是用物理或化学的方式将目标微生物全部杀灭，使之达到无菌保障水平，一般最常用的有化学试剂、射线、湿热、干热以及过滤等除菌手段。针对不同的微生物采用的方法也不一样。而想要验证这些方法的效果，就需要一些具有灭菌耐受力的活微生物作为指示物来进行判断。

今天我们要讲的枯草芽孢杆菌黑色变种主要用于各类医疗机构及制药工业领域的消毒效果验证中，其原理是经过灭菌处置后含有枯草芽孢杆菌黑色变种的水样在通过孔径为0.45um的滤膜后，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸琼脂培养基上，36℃±1℃培养72h-96h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检后通过生化试验做进一步鉴定，能利用甘油和甘露糖，可还原硝酸盐和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特征菌落为枯草芽孢杆菌黑色变种，鉴定结果为阳性。

检测所用试剂>

1.酪氨酸琼脂培养基。

2.营养琼脂培养基。

3.淀粉培养基和碘液。

4.硝酸盐还原培养基和相关试剂。

5.甘油复红肉汤培养基。

6.甘露糖生化培养基。

7.甘露醇生化培养基。

8.苦杏仁苷生化培养基。

9.革兰氏染色液。

10.芽孢染色液。

11.阴性对照菌：如地衣芽孢杆菌。

12.阳性对照菌：枯草芽孢杆菌黑色变种。

13.枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液

按照《消毒技术规范》的规定制备，也可购买浓度范围在106CFU/ml-109CFU/ml之间的市售枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液。

14.无菌滤膜：直径50mm，孔径0.45μm的醋酸纤维滤膜。

按无菌操作要求包扎，经121℃高压蒸汽灭菌20min，晾干备用；或将滤膜放入烧杯中，加入实验用水，煮沸灭菌3次，15min/次，前2次煮沸后需换水洗涤2-3次。也可采用市售的无菌滤膜。

15.石蜡质封口膜。

16.无菌水：取适量实验级纯水，经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

检测所需试剂>

1.样品瓶：螺口带盖或磨口具塞的250ml、500ml广口玻璃瓶。

2.恒温培养箱：36℃±1℃。

3.高压蒸汽灭菌器：121℃，可调。

4.pH计：准确到0.1pH单位或更高精度。也可使用pH精密试纸。

5.显微镜：物镜4×或5×、10×、20×、40×，油镜100×，目镜10×或15×。

6.分析天平：实际分度值0.0001g。

7.培养皿：直径90mm。

8.过滤装置：配有砂芯滤器、圆筒形玻璃漏斗和真空泵，抽滤压力不低于-50kPa。

9.接种环：直径1mm-3mm。

10.镊子：不锈钢或一次性无菌塑料镊子。

11.刻度移液管：1ml、10ml。也可使用可调式移液器。

12.量筒：100ml。

13.锥形瓶：100ml。

14.酒精灯。

15.试管：10ml。

16.无菌操作设备：无菌室、超净工作台、生物安全柜。

17.一般实验室常用仪器和设备。

水样采集>

评价使用高温高压灭菌设备的灭菌效果时，取样品瓶，加入枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液及200ml无菌水使混合液中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。灭菌处置完毕后，取出样品瓶，对水样进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。

评价使用其它灭菌设备的灭菌效果时，灭菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液加入灭菌设备，使水样中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。灭菌处置完毕后，从灭菌设备中采集水样，进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。采样量一般为样品瓶容量的80%左右，不得用样品洗涤样品瓶。样品采集完毕后，迅速用无菌包装纸包扎样品瓶。

样品采集后宜在2h内检测，否则应在10℃以下冷藏保存运输，但不得超过6h。实验室接收样品后，不能立即开展检测的，样品应在4℃以下冷藏保存，并在2h内检测。

水样过滤>

用无菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜贴放在已灭菌的过滤装置上，固定好过滤装置。将样品充分混匀后取100 ml 抽滤，以无菌水冲洗滤器内壁2-3 次。样品过滤完成后，再抽气约5s，关上开关。过滤前按照无菌操作要求调节样品的pH值至7.0-8.0。

培养流程>

用灭菌镊子夹取滤膜移放在酪氨酸琼脂培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后用石蜡质封口膜封好培养皿，倒置培养皿，放入恒温培养箱内，36℃±1℃培养72h-96h。

培养96h后，如培养基上未有菌落生长，则试验终止；如培养基上有菌落生长，则挑取黑色的特征菌落于营养琼脂培养基上，36℃±1℃培养24h，待鉴定。同时将已挑菌落的酪氨酸琼脂培养基培养皿储存于2℃-5℃，以备必要时复查。

染色镜检>

挑取黑色或可疑菌落，分别使用革兰氏染色液和芽孢染色液染色，枯草芽孢杆菌黑色变种革兰氏染色镜检以及芽孢染色镜检可以参考相关镜检图，枯草芽孢杆菌黑色变种为革兰氏阳性菌，营养细胞呈杆状，单个或呈短链状排列。

生化实验>

挑取黑色或可疑菌落，分别接种到淀粉培养基、硝酸盐还原培养基、甘油复红肉汤培养基、甘露糖生化培养基、甘露醇生化培养基和苦杏仁苷生化培养基上。

空白对照实验>

用无菌水按照过滤和培养步骤进行操作；培养96h后平板培养基上应无菌落生长，否则，该次样品鉴定结果无效，应查明原因后重新采样和检测。

阴性及阳性对照>

将阴性对照菌和阳性对照菌制成浓度为40CFU/L-600CFU/L的菌悬液，分别按照过滤、培养、实验的步骤操作。阴性、阳性对照菌呈现的生化反应结果应与参照表所列结果一致，否则该次水样鉴定结果无效，此时查明原因后重新采样和检测。

结果判断>

100ml水样中检出枯草芽孢杆菌黑色变种，即可断定灭菌不合格；而如果在100mL水样中未检出枯草芽孢杆菌黑色变种，可评价为灭菌合格。

「本文来源：南国早报」

近日，一名男婴在自治区妇幼保健院降生——

他是通过第三代试管婴儿技术孕育的。

跟以往的试管宝宝不同，这名男婴彻底摆脱了父母携带的异常染色体，阻断致病基因在家族中继续传递，

他

还是广西首例“脱染”宝宝。

女子两次流产

实为染色体异常

去年6月，韦女士夫妇到自治区妇幼保健院就诊。韦女士婚后曾怀孕过2次，均在孕早期因出现胚胎停育而流产，而且找不到原因。

经过染色体检测，发现她是一名“染色体平衡易位”携带者，丈夫染色体正常。

自治区妇幼保健院生殖医学中心主任周红介绍，“平衡易位”是染色体结构异常类型中的一种，携带者外表跟正常人无异，只有遇到特定事件时，异常才会显现出来。

比如一些夫妇在生育过程中会遇到不明原因的自然流产、死胎、死产、胎儿畸形等问题，约有40%是染色体异常导致的。其中最常见的一种就是染色体平衡易位，人群中的携带率约为1‰-2‰，只有通过染色体检测才能发现。

▲医务人员正在进行精液优选操作。院方供图

韦女士夫妇表示想生育一个健康的、不携带染色体平衡易位的宝宝。这需要第三代试管婴儿技术的帮助。

精准找出“十八分之一”

胚胎植入前遗传学诊断技术（PGD），俗称第三代试管婴儿技术，该技术能有效地防止遗传疾病患儿的出生，已经成功用于地中海贫血等遗传病的防治。

然而，要解决韦女士的问题，光有第三代试管婴儿技术还不够。

▲医务人员在进行胚胎培养。院方供图

据介绍，平衡易位携带者，与正常配偶结婚后，产生的胚胎仅有1/18的概率是染色体正常的胚胎，1/18的概率是携带染色体易位的胚胎，其余16/18为染色体异常，表现为不育、死胎、反复流产、胎儿畸形等严重问题。

前两个“1/18”，都呈现出“正常”，但存在本质的区别，一个是真正的正常，另一个则是“表面正常”，实际上仍然携带异常染色体，携带者到了生育时还是有可能面临困难。

而此前的技术还无法精准地分辨出这两者的区别。

更多家庭可能因此受益

韦女士夫妇二人决定通过第三代试管婴儿技术助孕，最终形成了12个优质囊胚。此时，

让第三代试管婴儿技术进一步升级的“MaReCs脱染”技术登场。

▲试管婴儿技术中的胚胎冷冻环节。院方供图

检测结果显示，12个囊胚中，只有1个完全正常。这枚完全正常的胚胎被移植进韦女士的体内，妊娠17周时检查结果提示，胎儿染色体核型和全基因组拷贝数变异检测无异常，与胚胎检测结果一致。

今年8月23日，韦女士足月妊娠顺利分娩一名6斤5两重的健康男婴。

利用等位基因映射技术（MaReCs）成功阻断染色体平衡易位向子代的传递，意味着广西的第三代试管婴儿技术更加精进，更多有生育问题的家庭将因此获益。

来源丨南国早报记者 张若凡

通讯员汪彩珠 何芸

值班编辑丨徐丽青

值班校对丨麦雪莉

值班主编丨谭双梅

值班编委丨周 寒

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